Van HPLC naar UHPLC: welke componenten?

Home / Van HPLC naar UHPLC: welke componenten moeten mee?

Van HPLC naar UHPLC: welke componenten moeten mee?

Druk, deeltjesgrootte en dood volume bij de overstap naar ultra-high performance

De overstap van HPLC naar UHPLC levert snellere analyses en betere scheiding op, maar vraagt om meer dan alleen een nieuwe kolom. UHPLC werkt met veel kleinere kolomdeeltjes en daardoor met aanzienlijk hogere drukken. Alle componenten in het stroompad moeten daarop zijn berekend.

Dit artikel laat zien welke componenten verschillen tussen HPLC en UHPLC, waarom die aanpassingen technisch noodzakelijk zijn, en welke fouten in de praktijk het vaakst worden gemaakt bij de overgang.

⏱ ca. 7 minuten leestijd

Waarom UHPLC hogere eisen stelt

UHPLC gebruikt kolomdeeltjes van ongeveer 1,7 tot 2 micrometer in plaats van de 3 tot 5 micrometer van klassieke HPLC. Dat heeft drie directe gevolgen:

De efficiëntie neemt toe: meer theoretische schotels per kolomlengte, dus meer scheidingsvermogen.
De optimale stroomsnelheid verschuift naar hogere waarden, waardoor analyses sneller kunnen.
De tegendruk stijgt sterk, omdat kleinere deeltjes meer weerstand bieden aan de vloeistofstroom.

Die derde consequentie is de reden dat alle componenten moeten worden herzien. Waar klassieke HPLC tot ongeveer 400 bar werkt, gaat UHPLC richting 1.000 tot 1.500 bar.

Componentvergelijking: HPLC versus UHPLC

Component	HPLC	UHPLC
Kolomdeeltjes	3 tot 5 micrometer	Circa 1,7 tot 2 micrometer
Systeemdruk	Tot circa 400 bar	Tot circa 1.000 tot 1.500 bar
Pomp	Lagere druk, standaard afdichtingen	Hogedrukpomp met versterkte afdichtingen
Injectieklep / autosampler	Geschikt voor lagere druk	Hogedrukbestendig, zeer nauwkeurige injectie
Capillairen en fittingen	Groter inwendig volume acceptabel	Zeer klein inwendig volume; minimaal dood volume
Detectorcel	Groter celvolume mogelijk	Kleiner celvolume tegen extra-kolom verbreding
Kolomoven	Standaard temperatuurregeling	Snellere en nauwkeurigere temperatuurregeling

De drie eisen aan elk onderdeel

Bij de overgang naar UHPLC moet elk component in het stroompad aan drie voorwaarden voldoen.

1. Hogere druk aankunnen

Pomp, injectieklep, kolomaansluitingen en fittingen moeten de systeemdruk veilig weerstaan. PEEK-fittingen die tot circa 400 bar geschikt zijn, volstaan niet meer bij UHPLC-drukken. Roestvrijstalen fittingen met bijpassende ferrules zijn dan noodzakelijk.

2. Minder dood volume veroorzaken

De winst van kleinere deeltjes gaat direct verloren als het systeem te veel extra-kolom volume heeft. Bij UHPLC met smalle kolommen (2,1 mm) moet het totale dode volume onder enkele microliters blijven. Dat vraagt om capillairen met kleine inwendige diameter, correct gemonteerde fittingen en een kleine detectorcel.

3. Sneller kunnen reageren

UHPLC-pieken zijn smaller en passeren de detector in kortere tijd. De detector moet daarom een hogere datasamplingfrequentie hebben en een lagere tijdconstante. Een detector met trage respons vervormt de piekvorm ongeacht hoe goed de kolom presteert.

Meest gemaakte fout bij de overstap

Een UHPLC-kolom installeren in een klassiek HPLC-systeem. De kolom levert dan wel hogere efficiëntie, maar het systeem haalt de optimale flow niet vanwege drukbegrenzing, en het aanwezige dode volume vernietigt de winst in piekvorm. Het resultaat is een dure kolom die nauwelijks beter presteert.

De 6-poorts injectieklep: waarom het ontwerp ertoe doet

De injectieklep bepaalt de vorm van de monsterband die de kolom binnengaat. Een 6-poorts klep werkt met een roterende rotor die tussen twee standen schakelt.

Load-stand: de sample loop vullen

De mobiele fase gaat rechtstreeks van de pomp naar de kolom. De sample loop is losgekoppeld van de mobiele-fasestroom. Het monster wordt via de injectiepoort in de loop gebracht; overtollig monster verlaat de lus via de afvalpoort. De lus bevat nu een exact bekend volume.

Inject-stand: het monster injecteren

De rotor draait ongeveer 60 graden waardoor de vloeistofroutes veranderen. De mobiele fase wordt nu door de sample loop geleid en neemt het monster mee naar de kolom. Het monster arriveert als een compacte plug.

Waarom zes poorten? De zes poorten maken het mogelijk om gelijktijdig de mobiele fase in en uit te laten stromen, de kolom aan te sluiten, de sample loop aan te sluiten en de spuitpoort met afval te verbinden. De rotor vormt intern de juiste verbindingen tussen deze poorten.

Effect op uw chromatografie

Een goed functionerende injectieklep geeft een smalle en reproduceerbare injectieband, beperkt extra-kolom piekverbreding en voorkomt variatie in retentietijden en piekoppervlakten. Een versleten rotorseal is een veelvoorkomende maar makkelijk over het hoofd geziene oorzaak van slechte reproduceerbaarheid.

Veelgestelde vragen over de overstap naar UHPLC

Kan ik mijn bestaande HPLC-methode direct overzetten naar UHPLC?

Niet één op één. U moet de methode schalen: de verhouding tussen kolomlengte, deeltjesgrootte, flow en injectievolume moet worden aangepast om dezelfde scheiding te behouden bij kortere analysetijd. Veel fabrikanten bieden rekenmodellen voor methodeschaling.

Zijn PEEK-fittingen bruikbaar bij UHPLC?

Voor de lagedrukzone (reservoir naar pomp, na de detector) blijven PEEK-fittingen prima bruikbaar. Voor de hogedrukzone tussen pomp en kolom zijn roestvrijstalen fittingen noodzakelijk vanwege de druk. Sommige versterkte PEEK-varianten halen hogere drukken, maar controleer altijd de specificatie.

Waarom presteert mijn UHPLC-systeem minder dan verwacht?

De meest voorkomende oorzaken zijn te veel extra-kolom volume, een detectorcel die te groot is voor de kolomdiameter, een te lage datasamplingfrequentie, of capillairen met te grote inwendige diameter. Loop het gehele stroompad na van injector tot detector.